文献解读|综合表观基因组和转录组分析揭示了JUNB对造血命运诱导的需求

研究介绍：

材料与方法：

图1、HPC分化过程中染色质状态的动态变化。显示hPSC的造血分化过程的示意图（上图）以及转录和染色质状态分析的样本收集策略（下图）。B各分化期RNA-Seq复制的PCA。HPSC、VME、EPC和HPC的C聚类图在启动子（TSS±2.5kb）处重复ATAC-seq信号。D条形图显示了所有分化期ATAC-seq、H3K4me3和H3K27me3芯片-seq数据的峰值分布。显示hPSC、VME、EPC和HPC中基因表达、H3K4me3、H3K27me3结合和染色质可及性之间的Pearson相关性的热图（TSS±2.5kb）。UCSC浏览器快照显示了代表标记基因在HPC分化的不同阶段的CHIP-SEQ和ATAC-SEQ图谱。每个面板左侧的热图显示了归一化的基因表达水平。基因组浏览器的查看比例根据全局数据范围进行调整。HPSC-、VME-、EPC-和HPC-推定的启动子为阴影。HPSC人多能干细胞、VME血管中胚层细胞、EPC内皮祖细胞、HPC造血祖细胞、源数据作为源数据文件提供‍。

图2、HPC分化过程中的时间表观遗传特征和基因表达模式。HPC分化过程中atac-seq峰的Mfuzz聚类分析。ATAC-SEQ峰被聚集成六个簇，并被分成三个类别。线条图描绘了标准化的ATAC-SEQ信号，其中每条灰线表示不同细胞群中相同位置的信号，而绿线表示每组的上和下四分位数之间的值。每个ATAC-seq簇中的H3K4me3和H3K27me3修饰的B信号。C每个簇中最接近ATAC-seq峰的基因的对数转化基因平均表达（读取计数）。d-f条形图显示了通过对不同类别的ATAC-SEQ星系团进行GO分析而丰富的统计上过高的生物过程。P值，Fisher‘s精确检验。G每个ATACseq类别中的TF基序丰富。点的大小反映了含有特定Tf基序的序列的比例，颜色显示了从Fisher的确切p值得到的丰富。HPSC人多能干细胞、血管中胚层细胞。EPC内皮祖细胞、HPC造血祖细胞。源数据以源数据文件的形式提供。‍

图3、组蛋白修饰景观在HPC分化过程中的动态变化。显示基于ChromHMM算法从芯片序列数据集中分类的染色质状态的热图。每行对应不同的组蛋白标记，每列代表不同的染色质状态。具有低H3K4me3或H3K27me3修饰的区域被标记为未标记；同时具有H3K4me3和H3K27me3的区域被标记为二价。较深的颜色表示更高的概率。B方框图，显示每个分化阶段对应的基因表达水平（上图）和染色质可及性（下图）。每个盒子的顶部都标有基因/峰值编号。显示细胞状态转变过程中二价结构域动态的示意图。显示hPSC向VME转变过程中H3K4me3（左）、H3K27me3（中）和激活的双价基因的基因表达（n=419）的动态的3D盒图。HPSC向VME转变过程中激活二价基因的EGO分析。UCSC浏览器视图显示了在hPSC向VME转变过程中代表基因座上的H3K4me3和H3K27me3修改概况。推定的推动者是阴暗的。显示VME向EPC转变过程中H3K4me3（左）、H3K27me3（中）和激活的双价基因的基因表达（n=253）的动态的G盒图。VME向EPC转变过程中激活的双价基因的HGO分析。UCSC浏览器快照显示了VME向EPC转变过程中具有代表性的基因座上的H3K4me3和H3K27me3图谱。推定的推动者是阴暗的。JUCSC基因组浏览器快照显示了H3K4me3和H3K27me3修饰图谱以及HOXA5、HOXA9和HOXA10基因座的染色质可访问性。推定的推动者是阴暗的。F，i，j中显示代表性基因表达水平的热图。B、d、g中的长方体边界是25%和75%，横跨长方体的水平线是中间值，胡须表示最小值和最大值。P值，Fisher‘s精确检验。基因组浏览器的查看比例根据全局数据范围进行调整。HPSC人多能干细胞、VME血管中胚层细胞、内皮祖细胞、HPC造血祖细胞。源数据以源数据文件的形式提供。‍

图4、ScRNA-seq和scATAC-seq分析揭示了ECs和早期HPC的亚群。显示单细胞RNA-seq和atac-seq的样本收集的示意图。圆点表示培养皿中不同类型的细胞。分化第6天细胞的单链RNA序列显示HPC、EC、MES和EPI簇的UMAP结果。来自SCATAC-SEQ数据的HPC、EC、MES和EPI星系团的UMAP可视化。CD34基因座周围有D个ScATAC-seq峰。新出现的开放区域有阴影。AECTI、AECTII、PreHPCTI、Pre-HPCTII和HE簇的scRNA-seq（左）和scATAC-seq（右）的UMAP图，来自B.f中描述的EC和HPC群体的重新聚类，显示了顶端deg在AECTI、AECTII、Pre-HPCTI、Pre-HPCTII和HE群体中的表达。AECTI、AECTII、Pre-HPCTi、Pre-HPCTII和HE群体的G，h细胞周期和轨迹分析。在AECTI、AECTII、Pre-HPCTI、Pre-HPCTII和HE人群中，具有代表性的HPC和AEC相关基因在EHT过程中的表达。HPSC人多能干细胞。VME血管中胚层细胞、EPC内皮祖细胞、HPC造血祖细胞、EPI上皮细胞、MES中胚层细胞、EC内皮细胞、HE血源性内皮细胞、AEC动脉内皮细胞、AECTI、AEC-I型、AECTII、AEC-II型、HPC前TI型前HPCI型、Pre-HPCTIIPre-HPC型II、源数据作为源数据文件提供。‍

图5、体外和在体HEC单细胞转录组的比较。显示CS10HEC、CS13HEC和体外HEC基因表达模式的热图。颜色渐变表示基因表达的值。B散点图分别显示了体外HEC、CS10HEC和CS13HEC与决定系数的相关性。差异表达的基因被突出显示。蓝点、红点和灰点分别代表体外HEC中上调基因、下调基因和稳定基因。CS10HEC、CS13HEC和体外HEC中最高差异表达基因的CGO分析。点的颜色显示了从Fisher的精确p值中得到的丰富。CS-Carnegie分期，HEC造血内皮细胞。源数据以源数据文件的形式提供。‍

图6、表观遗传学特征表明JUNB是一种潜在的造血调节因子。热图显示了其结合基序在图2G中的类别II和III中丰富的二价TF的表达水平（FPKM）。颜色渐变表示基因表达的值。UCSC基因组浏览器快照显示H3K4me3、H3K27me3和ATAC-seq信号在JUNB的推定启动子处出现峰值，推定启动子为阴影。C小提琴图显示，在图4B的scRNA-seq图中，JUNB在EC和HPC簇中的表达较高。AECTI、AECTII、Pre-HPCTi、Pre-HPCTII和HE群体中JUNB的D基序丰度。E-Bar图显示JUNB在CS10HEC（n=124）、CS13HEC（n=21）和体外HEC（n=119）中的表达水平。数据以平均值±SEM值表示。P值，双尾非配对t检验。FHPC差异化期间MYB、MEIS1、RUNX1和JUNB基序的ATAC-SEQ足迹可视化。将基因组中所有这些基序结合位置上的ATAC-SEQ信号与基序进行比对并取平均值。HPSC人多能干细胞、VME血管中胚层细胞、EPC内皮祖细胞、HPC造血祖细胞、外周上皮细胞、MES中胚层细胞、EC内皮细胞、HE造血内皮细胞、AEC动脉内皮细胞、AECTIAEC-I型、AECTIIAEC型II、HPC前TI型前HPC、Pre-HPCTIIPre-HPC型。‍

图7、JUNB缺乏严重损害hPSC向HECs和HPC的分化。示意图显示在起始密码子附近以JUNB为靶点的sgRNA。绿色箭头代表基因分型的聚合酶链式反应引物。B代表性的流式细胞仪密度图并定量检测WT和KO细胞第8天的HPC（CD34+CD43+），n=3个独立实验。与WT相比，JUNBKOCD34+EPC中上调的基因表达增加。P值，Fisher‘s精确检验。流式细胞仪检测WT和JUNBKO细胞第6天−和CD73−的密度图和数量。N=3个独立实验。E热图显示在WT和JUNBKOHECS中对HEC特性重要的基因的表达水平。颜色渐变表示基因表达的值。F-TF与JUNB在RUNX1和CD44基因组座位上的结合。推定的推动者是阴暗的。G-JUNB可诱导表达结构图。显示HPC分化过程中DOX诱导窗口的示意图。I-Bar图显示，阿霉素诱导的异位JUNB表达在第3天至第5天部分挽救了内皮细胞（CD34+CD73−CD184−）的百分率。N=3个独立实验。J-Bar图显示，在HEC规范或EHT窗口期用DOX诱导JUNB的表达可显著挽救HPC（CD34+CD43+）百分率。N=3个独立实验。HPC造血祖细胞、HEC造血内皮细胞、EHT内皮-造血细胞转化、WT野生型、KO基因敲除。对于条形图b、d、i、j，数据以平均值±SD表示。P值，双尾非配对t检验。源数据以源数据文件的形式提供。‍

结论：