文献解读|基于转录组-蛋白质组数据联合分析对煎蛋水母毒性评价、毒素筛选及其干预

材料与方法

材料：

在上海的一个人工水族箱搜集水母，然后将活物运送到实验室，进行实验。

方法：

（1）生物信息学分析

所有组装的unigenes都使用软件DIAMOND进行NR、SwissProt、GO、KEGG数据库注释，所有的蛋白质整合数据库都使用de novo组装的转录组进行注释。从构建的转录组中收集细胞色素c氧化酶亚基I（CO1）序列，或通过NCBI核苷酸数据库在构建了目标序列和比对序列的fasta文件后，通过Neighbor-joining聚类法在MEGA7中进行系统发育树绘制。毒素筛选是基于Blastx（核苷酸到蛋白质）对NR和Swissprot等数据库进行转录组和蛋白质组的筛选。通过管家基因GAPDH计算各毒性蛋白及其相关unigenes的表达水平。

（2）生存分析

ICR小鼠（20±2 g）被注入PBS-diluted触手提取物（0~6mg/kg，n = 12）通过尾静脉，然后观察16 h。计算半数致死量（LD50）。选择Ca2⁺通道抑制剂盐酸地尔硫卓（1.0 mg/kg）（APExBIO）和金属蛋白酶抑制剂金属螯合剂EDTA（0.2 mg/kg）（Bio-Light）进行干预实验。将触手提取物分别与抑制剂预混，最终剂量为4.2 mg/kg，然后通过尾静脉给小鼠注射混合样品并观察16 h。

（3）血液生化分析

12只ICR小鼠注射触手提取物3.60 mg/kg。注射6 h后，5只存活小鼠经内眼角取血。同时，阴性组的血液样本取自另外5只注射PBS的小鼠。新鲜血液立即以2000g离心10 min，收集清上清，测定血液生化指标，心脏指标LDH、CK、CK-mb，肝脏指标ALT、AST，肾脏指标sCre、BUN。

（4）酶活性测试

采用纤维蛋白原（6.0 mg/mL）作为底物，通过纤维蛋白原溶解法测定酶活性。样品分为8组，除对照组外，每孔加21 μg纤维蛋白原，然后分别加0 ~ 24 μg触手提取物。用PBS稀释触手提取物和纤维蛋白原的混合物，然后在37◦C下孵育16小时，通过SDS-PAGE进行评估。

（5）溶血性试验

将通过ICR小鼠内眦抽出的血样离心并用PBS洗涤三次，然后重悬于PBS中，最终浓度为0.45%（v/v）。将 0.45% 红细胞悬液与阴性PBS对照、实验触手提取物（0 ~ 800 µg/mL） 和阳性皂苷（30 µg/mL）对照在37°C下孵育30分钟。在以2000g离心10分钟后，取上清液并在415 nm处用分光光度法（Synergy 2，BioTek）测量。最后，在去除PBS阴性对照作为背景的条件下，将溶血活性表示为与在皂甙和0.45%红细胞上清液下最大溶解后的吸光度相比的百分比。

（6）细胞毒性测试

通过Cell Counting Kill（CCK-8）试剂盒（GLPBIO）测定细胞存活。将HEK 293 T细胞以1 × 105细胞/mL的密度置于96孔培养板中。37◦C，5% CO2培养24 h后，弃上清液，用100 μL触须提取物（0 ~ 800µg/mL，n = 6）处理细胞，阴性组用等量的DMEM（BasalMedia）处理6 h。100 μL 10% CCK-8试剂，在DMEM中预先稀释，在37◦C下再孵育4小时。使用酶标仪（BioTek）测量450 nm处的吸光度。

（7）红细胞膜蛋白质组学

局部blast用于从蛋白质组数据库中筛选粘附在红细胞膜上的毒素，也用于比对转录组蛋白质组中筛选的所有金属蛋白酶之间的序列相似性。从uniprot下载的正常小鼠蛋白质组数据库共有36，967个蛋白质。将PBS处理后的红细胞膜和触手提取液同时与正常小鼠蛋白质组数据库和camtschatica的蛋白质组数据库进行局部blast比对。根据之前筛选的毒素数据库，进一步筛选触手提取物处理的红细胞膜中筛选出的不同肽。感兴趣蛋白的三维建模由SWISS-MODEL，由Discovery studio展示。所有筛选的金属蛋白酶毒素在转录组为基础的蛋白质组中的系统发育树由MEGA7构建。

结果

图1. 物种鉴定及其转录组和蛋白质组

(A) 水母样本图像。（B）系统发育树由CO1 TRINITY DN3114 c0 g1的核苷酸序列，利用MEGA 7软件，通过bootstrap共识树法构建。TRINITY DN3114 c0 g1用红色圆圈标记。（C）利用MEGA 7软件，用CO1 TRINITY DN3114 c0 g1的氨基酸序列，通过bootstrap共识树法构建系统发育树。（D）提取总RNA的质量检测。电泳道清晰显示出28S、18S和5S三条谱带。（E）GC含量分布。（F）unigenes长度分布。（G）unigenes表达量分布。（H）SDS-PAGE的代表图像。（I）肽段长度分布。（J）肽计数分布。（K）等电点PI分布。左纵坐标表示unigenes/蛋白的数量，右纵坐标表示unigenes/蛋白的累计百分比。

图2. unigenes和蛋白质的GO和KEGG分析

(A) GO 结果概括为三个主要类别，包括细胞成分（CC）、生物过程（BP）和分子功能（MF）。（B ~ G）：2 级 KEGG 通路：（B）细胞过程。（C）环境信息处理。（D）遗传信息处理。（E）人类疾病。（F）新陈代谢。（G）有机系统。（H）丰富的3级KEGG 通路。

图3. 煎蛋水母触手提取物的毒性评价

（A）不同触手提取物浓度（0 ~ 6.0 mg/kg）（n = 12）刺激的小鼠存活率。（B）计算完整ICR小鼠触手提取物的LD50。（C）心脏功能指标LDH和CK（n = 5）。（D）肝功能指标 ALT 和 AST （n = 5）。（E）肾功能指标sCre和BUN（n = 5）。（F）触手提取物的溶血（n = 6）。（G）CCK8（n = 6）在HEK293细胞上测试了触手提取物的细胞毒性。（H）触手提取物和纤维蛋白原的混合物在37 ℃孵育16 h后通过SDS-PAGE检测蛋白酶活性。α：纤维蛋白原的α链；β：纤维蛋白原的β链；γ：纤维蛋白原的γ-链；DPI：消化的蛋白质I；DPII：消化蛋白II；M：蛋白质标记；泳道1 ~ 8：0、0.07、0.21、0.7、2.1、7、21 和24 μg 触手提取物。（I）图像J用于计算非DP波段（α、β和γ-链）和DP波段（DPI和DPII）的平均强度。**p < 0.01。

图4. 基于转录组和蛋白质组的毒素筛选

(A) 在煎蛋水母的转录组和蛋白质组中筛选的潜在毒素。（B）煎蛋水母转录组和蛋白质组中不同毒素家族的比例。（C）针对NR和Swissprot 数据库的毒素鉴定。横坐标上列出的四种毒素是总毒素中的代表毒素。（D）毒素的分子量（MW）和PI分布。横坐标上列出的四种毒素是总毒素中的代表毒素。（E）前30名的毒素在转录组和蛋白质组中进行了比较分析。所有与GAPDH相关的unigenes和蛋白质均通过log2（倍数变化）计算并通过热图显示。

图5. 附着在小鼠红细胞膜上的触手提取物的蛋白质组和两种锌金属蛋白酶的3D建模

(A) PBS处理的小鼠红细胞组和触手提取物处理的小鼠红细胞组（n = 4）之间通过 LC-MS/MS鉴定的肽的维恩图。（B）在PBS处理的小鼠红细胞和触手提取物处理的小鼠红细胞之间从小鼠蛋白质组排列的蛋白质的维恩图。（C）PBS处理的小鼠红细胞和触手提取物处理的小鼠红细胞之间从煎蛋水母蛋白质组排列的蛋白质的维恩图。（D）粘附在红细胞上的毒素和非毒素的数量。**p < 0.01。（E）粘附在红细胞上的毒素的表达率。“金属蛋白酶…（1）”、“C-型凝集素…”、“N-酰基磷脂…”、“金属蛋白酶…（2）”、“跨膜…丝氨酸（1）”、“跨膜…丝氨酸（2）”代表如“锌金属蛋白酶nas-15-like （1）”、“C-型凝集素结构域家族4成员 M”、“N-酰基-磷脂酰乙醇胺-水解磷脂酶D-like”、“锌金属蛋白酶 nas-15-like”、“跨膜蛋白酶丝氨酸9样”和“跨膜蛋白酶丝氨酸6”，分别。（F）NR和Swissprot 数据库中毒素的鉴定分布。（G）兆瓦和毒素的PI分布。（H）TRINITY DN10354 c0 g1（锌金属蛋白酶nas-15-like（1））的3D建模由SWISS-MODEL使用模板（PDB ID: 3U1R）模拟，然后由Discovery Studio 4.5 查看。TRINITY DN10354 c0 g1与模板的差异用黑色字体和红色箭头标记。灰色、绿色、蓝色和红色分别代表线圈、转弯、薄片和螺旋。（I）MEGA 7采用邻接法构建基于蛋白质组的所有金属蛋白酶的系统发育树。TRINITY DN10354 c0 g1和 TRINITY DN11567 c0 g1（锌金属蛋白酶nas-15-like（1）/（2））用红色和绿色圆圈标记，而其他用蓝色圆圈标记。

图6. 两种常见抑制剂的毒性干预

(A) PBS-触手提取物、地尔硫卓-触手提取物、EDTA-触手提取物、地尔硫卓-PBS和 EDTA-PBS组（n = 12）中小鼠的生存分析。（B）LDH和CK评估（n = 5）。（C）ALT和AST评估（n = 5）。（D）sCre评估（n = 5）。**p < 0.01。

结论

通过形态学观察和COI进化分析，成功鉴定样品为地中海煎蛋水母（Phacellophora camtschatica）。通过重新组装转录组和蛋白质组，共获得25747个unigenes和3058个蛋白质。在数据库GO和KEGG中分别标注了6869（26.68%）和6618（25.70%）的unigenes，以及2536（82.93%）和2844（93.00%）的蛋白。毒性评价结果表明，触手提取物具有较强的致死率、蛋白酶活性、溶血活性和细胞毒性。此外，通过blastx从NR和Swissprot数据库的120个毒素相关ungenes中筛选出62个毒素，包括16个金属蛋白酶、11个磷脂酶、11个丝氨酸蛋白酶等。其中，11种毒素粘附在红细胞膜上，基于红细胞蛋白组进一步定量。Ca2⁺通道抑制剂地尔硫卓能显著提高ICR小鼠的存活率，而金属螯合剂EDTA能稍微延长ICR小鼠的生存时间。煎蛋水母是一种具有多种毒性成分的观赏性有毒水母，金属蛋白酶可能在体内外毒性中发挥重要作用，细胞外Ca2⁺进入可能是其全身性致命毒性的主要机制。